Lấy ý tưởng từ series game giải đố Professor Layton trên hệ máy NDS, "Giáo sư Layton và nàng ca nữ vĩnh hằng" diễn ra ngay sau những sự kiện trong phiên bản "Giáo sư Layton và chiếc sáo ma thần". Mở đầu, Layton nhận được một lá thư từ học trò cũ, nay là nữ ca sĩ opera Jenice Caitly. Lá thư mời Layton đến dự buổi biểu diễn của cô. đồng thời mong Layton giúp đỡ cô giải quyết một sự bí ẩn kì lạ. Đó là việc cô bạn thân nhất của cô, Milena, người đã mất từ một năm trước nay sống lại dưới hình dạng một bé gái 7 tuổi, và nói rằng đã tìm thấy bí mật về sự trường sinh. Và khi Layton cùng cậu bé học việc Luke của mình tới nhà hát Crown Petone, họ đã vướng vào một trò chơi sinh tử mà người tồn tại cuối cùng sẽ nhận được sự trường sinh. Như thế, cuộc phiêu lưu giải đố bí ẩn đầu đầu tiên của Luke cùng với Layton bắt đầu.